Editarea genelor este un instrument care şi-a dovedit importanţa atât în cercetare, cât şi în terapie. De la apariţia tehnologiei CRISPR/Cas9, un instrument rapid şi precis pentru editarea genomului descoperit în 2012, recompensată şi cu Premiului Nobel, oamenii de ştiinţă lucrează pentru a-i explora capacităţile şi a-i spori performanţa.
Cercetătorii laboratorul de biologie de la universitatea California, din Santa Barbara, Statele Unite, au adăugat la acest set de instrumente în creştere, o nouă metodă care sporeşte eficienţa editării CRISPR/Cas9 fără a utiliza material viral pentru a livra şablonul genetic utilizat pentru a edita secvenţa genetică ţintă.
Potrivit unui nou studiu, publicat în revista Nature Biotechnology, noua metodă stimulează repararea bazată pe omologie (o etapă a procesului de editare a genelor) de aproximativ trei ori „fără a creşte frecvenţa mutaţiilor sau a modifica rezultatele reparaţiilor genetice".
„Am găsit o modificare chimică care îmbunătăţeşte editarea genetică non-virală şi am descoperit, de asemenea, un nou tip de reparare a ADN-ului", a declarat Chris Richardson, şeful laboratorului care a făcut recentele descoperiri.
Metoda CRISPR/Cas9 funcţionează prin valorificarea unei tehnici de apărare folosite de bacterii împotriva atacatorilor virali.
Pentru a face acest lucru, bacteriile taie o bucată din materialul genetic al virusului invadator şi îl încorporează în propriul material genetic pentru a-l recunoaşte ulterior. În cazul în care bacteriile sunt reinfectate, ele pot viza secvenţele genetice, acum familiare, pentru a le distruge.
În editarea genelor, acest proces foloseşte enzima Cas9 ca „foarfecă" moleculară pentru a tăia secvenţele pe care le recunoaşte, ghidată de sistemul CRISPR.
Această editare este, de asemenea, o oportunitate de a înlocui genele secţionate cu altele similare (omologe), dar îmbunătăţite, utilizând mecanismele naturale de reparare ale celulei. Dacă are succes, celula ar trebui să aibă ulterior expresii şi funcţii modificate.
Pentru a livra ADN-ul şablon de reparare în nucleul celulei, unde trăieşte materialul său genetic, se folosesc adesea viruşi.
Deşi sunt eficiente, spun cercetătorii, fluxurile de lucru virale „sunt costisitoare, dificil de extins şi potenţial toxice pentru celule".
Şabloanele non-virale sunt potenţial mai puţin costisitoare şi mai scalabile, deşi cercetătorii trebuie totuşi să depăşească barierele legate de eficienţă şi toxicitate.
În studiul recent, laboratorul Richardson a constatat că introducerea legăturilor încrucişate între şiruri în fluxul de lucru a crescut dramatic repararea dirijată prin omologie.
„Fiecare flux de lucru în care am introdus această abordare a funcţionat de aproape trei ori mai bine", a declarat Richardson.
Legăturile încrucişate între şiruri sunt leziuni care menţin şirurile duble ale unui helix de ADN legate unul de celălalt, făcându-le incapabile să se reproducă.
Chimioterapiile împotriva cancerului folosesc acest mecanism pentru a întrerupe creşterea tumorilor şi pentru a distruge celulele canceroase.
Cu toate acestea, adăugate la un şablon de reparare dirijată prin omologie, s-a constatat că aceste legături încrucişate stimulează mecanismele naturale de reparare ale celulei şi cresc probabilitatea de succes a editării.
„Practic, ceea ce am făcut a fost să luăm acest ADN şablon şi să îl deteriorăm", a declarat Richardson.
„L-am deteriorat, de fapt, în cel mai grav mod la care ne-am putut gândi. Iar celula în loc să spună: Hei, ăsta este un gunoi; lasă-mă să îl arunc, spune de fapt: Hei, asta arată grozav; lasă-mă să o adaug la genomul meu", a explicat cercetătorul.
Rezultatul este un sistem nonviral de editare genetică extrem de eficient şi puţin predispus la erori, spun cercetătorii.
Descoperirea lor, la fel ca multe descoperiri în ştiinţă, a fost de fapt un accident fericit.
În timp ce lucrau la purificarea proteinelor pentru a studia repararea ADN-ului, cercetătorii au observat schimbări neaşteptate în rezultatele experimentelor.
„Introduceam aceste modificări chimice în şabloanele de ADN pentru a le putea scoate din celule şi a vedea ce proteine erau legate de ele, şi verificam dacă această modificare a afectat cumva editarea în vreun fel", explică. Hannah Ghasemi, principala autoare a studiului.
„Mă aşteptam să nu văd nicio schimbare, sau să văd că a afectat negativ editarea", spune ea.
Cercetătorii au găsit în schimb un efect pozitiv, de până la trei ori mai mare decât activitatea de editare a controalelor.
Mai mult, echipa a constatat că, chiar şi cu creşterea numărului de editări, şi, prin urmare, a şanselor de eroare, nu a existat nicio creştere a frecvenţei mutaţiilor.
În prezent, echipa încă investighează mecanismele specifice care au condus la acest rezultat.
„Ceea ce credem că se întâmplă este că celula detectează şi încearcă să repare ADN-ul deteriorat la care am adăugat această legătură încrucişată", a declarat Richardson.
„Şi, făcând acest lucru, întârzie celula dincolo de un punct de control în care, în mod normal, ar trebui să oprească acest proces de recombinare. Şi astfel, prelungirea timpului de care are nevoie celula pentru a face această recombinare, face mai probabil ca modificările să meargă până la capăt"
Studierea acestui nou proces ar putea duce, de asemenea, la o mai bună înţelegere a modului în care celulele detectează reactivii de editare şi cum „decid" să îi accepte sau nu, spun cercetătorii.
Potrivit echipei, această metodă îşi va găsi cea mai mare utilizare în aplicaţiile de editare genetică ex-vivo, adică în domeniul cercetării bolilor şi al activităţii preclinice.
„Putem să eliminăm mai eficient genele şi să inserăm lucruri în genomuri pentru a studia sistemele din afara corpului uman într-un cadru de laborator", spun autorii.
Această realizare le permite să construiască mai eficient modele de boli şi să testeze ipoteze despre modul în care funcţionează bolile, ceea ce ar putea îmbunătăţi abordările clinice şi terapeutice.
