În interiorul ochiului uman, retina este alcătuită din mai multe tipuri de celule, inclusiv fotoreceptorii care detectează lumina şi care iniţiază cascada de evenimente care duc la apariţia vederii. Deteriorarea fotoreceptorilor, fie prin boli degenerative, fie prin leziuni, duce la afectarea permanentă a vederii sau la orbire.
Specialiştii spun că terapia de înlocuire a celulelor stem cu ajutorul fotoreceptorilor crescuţi în laborator reprezintă o strategie promiţătoare de combatere a bolilor de retină.
Provocarea constă în faptul că tratamentele cu celule stem care vizează înlocuirea fotoreceptorilor trebuie să fie mai întâi testate pe animale. Întrucât celulele umane nu sunt compatibile în alte specii şi sunt rapid respinse atunci când sunt transplantate, este dificil să se evalueze potenţialul lor.
„Retinele porcină şi umană împărtăşesc multe caracteristici cheie, ceea ce face ca porcii să fie ideali pentru modelarea bolilor retiniene umane şi testarea terapiilor oculare”, a declarat miercuri, David Gamm, director al Institutului de cercetare oculară McPherson din UW-Madison şi profesor de oftalmologie şi ştiinţe vizuale, într-un comunicat.
Prin testarea fotoreceptorilor „echivalenţi umani" la porci, se poate obţine o imagine mai bună a ceea ce pot face aceste celule dacă nu sunt atacate imediat de animalul gazdă, spune cercetătorul.
Într-un nou studiu publicat recent în revista Stem Cell Reports, laboratorul Gamm a colaborat cu cercetătorii de la Institutul de cercetare Morgridge pentru a dezvolta organoizi retinieni de porc crescuţi în laborator. Cercetătorii au descoperit că fotoreceptorii derivaţi de la porci prezintă multe asemănări cu cei realizaţi din organoizi de retină umană.
„Este pentru prima dată când oamenii au fabricat organoizi retinieni de porc”, spune Kim Edwards, student absolvent care lucrează în laboratorul lui Gamm şi primul autor al studiului. „Este prima dată când facem o comparaţie între organoizii retinieni umani şi cei dintr-o altă specie”, a precizat tânărul cercetătol.
Organoizii sunt grupuri mici de ţesuturi - de mărimea unui cap de bold mai mare - formate din sute de mii de celule, care permit oamenilor de ştiinţă să reproducă interacţiunile celulare şi condiţiile dintr-un ţesut sau organ uman, dar în mediul controlat al unei farfurii de laborator.
Un organoid retinian examinat într-un stadiu incipient de diferenţiere prezintă diferite celule vizualizate prin imunocitochimie. Credit: Kim Edwards.
„Celulele fotoreceptoare din organoizii umani pot răspunde la lumină şi pot comunica între ele prin conexiuni sinaptice”, explic[ prof. Gamm. Pentru a determina dacă acestea se pot conecta în interiorul unei retine deteriorate şi pot restabili vederea, acestea trebuie transplantate şi testate la porci.
Cercetătorii spun că, pentru a obţine organoizi de calitate, este important să se înceapă cu celule stem de calitate. Ei au colaborat cu Universitatea Calgary pentru a obţine celulele stem pluripotente de porc.
După ce au reuşit să genereze celule stem pluripotente induse, de la porci, următoarea provocare a fost să le încurajeze să se diferenţieze în celule retiniene. Cercetătorii au utilizat protocolul pentru organoizi umani stabilit de laboratorul prof. Gamm pentru a vedea dacă ar funcţiona folosind celule stem de porc.
Calendarul protocolului se baza pe perioada de gestaţie umană de 40 de săptămâni, însă cercetătorii au observat că sarcina unui porc durează doar jumătate din această perioadă. Astfel, oamenii de ştiinţă s-au gândit, să folosească acelaşi protocol, cu timpul redus la jumătate?
Cercetătorii au fost capabili să producă o mulţime de organoizi retinieni prin acest protocol, ceea ce face dovada conceptului pentru această abordare.
Utilizând tehnici de imunocitochimie, cercetătorii au identificat proteine asociate cu celule retiniene specifice, prezente în stadii timpurii comparativ cu stadii tardive de dezvoltare, în modele organoide derivate atât din porc, cât şi din om.
Pentru o analiză mai aprofundată, laboratorul prof. Gamm a colaborat cu specialişti în biologie computaţională, de la Institutul Morgridge, pentru a analiza expresia genelor din cadrul celulelor utilizând secvenţierea ARN pe o singură celulă (ARN-seq).
Organoizii sunt disociaţi în celule individuale, iar fiecare celulă este marcată cu un cod de bare şi secvenţiată individual. Datele capturate sunt apoi utilizate pentru a grupa celulele similare, oferind o perspectivă aprofundată asupra naturii tuturor tipurilor de celule găsite în organoid, inclusiv fotoreceptorii cu bastonaşe şi conuri şi alte tipuri de celule, cum ar fi celulele ganglionare retiniene.
Este o perspectivă obiectivă şi foarte cuprinzătoare asupra genelor exprimate în fiecare tip celular din organoid, spun cercetătorii. „Este un tip diferit de marker faţă de cel utilizat în imunochimie. Practic, este o modalitate diferită de a ajunge la aceeaşi concluzie, şi anume identificarea diferitelor tipuri celulare”, clarifică Beth Moore care a făcut parte din grupul de specialişti bioinformaticieni de la Morgridge.
Cercetătorii au trebuit să depăşească provocări pentru a ajunge la aceste concluzii. În primul rând, având în vedere natura organoizilor, au trebuit să-şi optimizeze protocoalele pentru a separa celulele şi a le menţine înainte de secvenţiere.
„Nu le place să fie disociate şi puse pe o farfurie, în special fotoreceptorii”, spune Edwards. „Glumim spunând că fotoreceptorii lucrează mai bine împreună, la fel ca oamenii”.
În ceea ce priveşte analiza datelor, cercetătorii explică faptul că fiecare celulă este încapsulată într-o picătură care conţine codul de bare pentru secvenţiere. Dar, uneori, o picătură încapsulează mai multe celule, sau picătura poate fi goală şi nu conţine nicio celulă, ceea ce introduce erori în datele de secvenţiere.
Acest lucru poate da peste cap analiza, mai ales atunci când se încearcă identificarea diferitelor tipuri de celule, spun cercetătorii. Ei au dezvoltat un protocol de analiză pentru a elimina secvenţele nedorite şi pentru a normaliza datele. Ulterior, ei au identificat genele exprimate în diferite grupuri celulare, pe care le-au putut corela cu tipuri celulare specifice şi compara cu rezultatele obţinute prin imunocitochimie.
O altă provocare – diferenţa semnificativă dintre genomul porcului şi cel uman – a însemnat că cercetătorii au trebuit, de asemenea, să parcurgă o listă de gene cunoscute din ambele specii şi să le coreleze cu secvenţele obţinute, pentru a putea identifica diferitele tipuri celulare.
Această cercetare a fost susţinută de finanţări din partea Departamentului american al Apărării, în colaborare cu Institutul Naţional al Ochiului, cu scopul de a explora terapia de înlocuire a celulelor pentru a trata leziunile retinei care apar frecvent în armată.
Cercetătorii testează acum această abordare prin transplanturi la porci folosind fotoreceptori din organoizii de porc pentru a determina dacă aceştia stabilesc conexiuni şi fac sinapse cu neuronii.
