Tehnica de editare genetică CRISPR-Cas9 este utilizată pe scară largă pentru a edita genomul prin studierea genelor de interes şi modificarea genelor asociate bolilor. Cu toate acestea, acest proces este asociat cu efecte secundare, inclusiv mutaţii nedorite şi toxicitate. O nouă tehnologie ar putea reduce aceste efecte secundare pentru a îmbunătăţi utilitatea sa în medicină şi industria alimentară.
Cercetătorii japonezi au dezvoltat o metodă optimizată de editare a genomului care reduce foarte mult mutaţiile, deschizând calea către tratamente mai eficiente pentru bolile genetice.
Tehnologia de editare a genomului, CRISPR-Cas9, a revoluţionat industriile medicală şi alimentară. În cadrul acestei tehnologii, nucleaza Cas9, o enzimă care poate edita ADN-ul, este introdusă în celulă împreună cu un ARN sintetic de ghidaj (ARNg). Acesta ghidează enzima către locul necesar de editare a genomului.
Prin editarea genomului, genele nedorite pot fi eliminate, iar genele noi (funcţionale) pot fi adăugate uşor şi rapid.
Totuşi, există preocupări tot mai mari cu privire la mutaţii şi la efectele în afara ţintei, legate de editarea genomului. Acest lucru este adesea cauzat de faptul că enzima ţinteşte site-uri genomice care au o secvenţă similară cu zona ţintă.
În mod similar, atunci când genele sunt modificate, pot apărea mutaţii la nivelul cromozomilor, ceea ce reprezintă o piedică în testarea clinică a terapiilor genice pentru cancer şi chiar a dus la decesul unor pacienţi care urmau un tratament pentru distrofia musculară.
În noul studiu, grupul de cercetare a emis ipoteza că protocoalele actuale de editare care utilizează Cas9 provoacă o scindare excesivă a ADN-ului, ceea ce duce la apariţia unora dintre mutaţii.
Pentru a testa această ipoteză, cercetători de la facultatea de medicină a universităţii Nagoya şi de la universitatea Kyushu, din Japonia, au construit un sistem numit „AIMS" în celule de şoarece, care a evaluat activitatea enzimei Cas9 separat pentru fiecare cromozom.
Rezultatele au arătat că metoda folosită în mod obişnuit era asociată cu o activitate de editare foarte mare. Cercetătorii au stabilit că această activitate ridicată cauzează unele dintre efectele secundare nedorite, aşa că au căutat metode de modificare a ARNg care să suprime această activitate.
Echipa a descoperit că o extensie suplimentară de citozină la capătul 5' al ARNg s-a dovedit eficientă ca o „protecţie" pentru activitatea excesivă şi a permis controlul asupra scindării ADN.
Ei au numit acest sistem de reglaj fin ARNg de protecţie ([C]gRNA).
Potrivit cercetătorilor, rezultatele au fost uimitoare. Cu ajutorul noii tehnici, efectele în afara ţintei şi citotoxicitatea au fost reduse, eficienţa editării selective a unei singure alele a fost crescută, iar eficienţa reparaţiei dirijate de homologie, cel mai frecvent utilizat mecanism de reparare a rupturilor de dublu catenar al ADN, a fost îmbunătăţită.
Pentru a testa eficacitatea sa într-un cadru medical, cercetătorii japonezi au investigat o boală rară numită fibrodisplazie osifică progresivă.
Folosind un model de şoarece, ei au reuşit să creeze acelaşi genotip ca al versiunii umane a bolii. Folosind apoi celule iPS (celule stem pluripotente induse) provenite de la pacienţi, au reuşit să repare cu precizie daunele până la o singură nucleotidă în mod specific în alela asociată bolii, demonstrând utilitatea tehnicii ca metodă sigură şi eficientă de terapie genică.
De asemenea, echipa a construit primul model matematic al corelaţiei dintre diverse modele de editare a genomului şi activitatea Cas9, care ar permite utilizatorului să simuleze rezultatele editării genomului într-o întreagă populaţie de celule.
Această descoperire ar permite cercetătorilor să determine activitatea Cas9 care să maximizeze eficienţa, reducând costurile foarte mari şi munca necesară.
„Am stabilit o nouă platformă de editare a genomului care poate maximiza eficienţa dorită a editării prin dezvoltarea de [C]gRNA care reglează activitatea Cas9", a declarat profesorul Hiroshi Suzuki de la facultatea de medicină a universităţii Nagoya.
Mai mult, cercetătorii au descoperit că 'ARNg de protecţie' poate fi aplicat la diverse instrumente CRISPR care necesită ARNg pentru reglarea activităţii, cum ar fi cele care utilizează Cas12a, care are un mecanism diferit de scindare a ADN-ului.
Potrivit acestuia, tehnicile care utilizează enzima Cas9 pentru a activa sau reprima genele de interes, cum sunt şi acrtivarea şi interferenţa CRISPR, inducerea sau suprimarea excesivă a expresiei genice poate să nu fie utilă şi se poate dovedi chiar dăunătoare pentru celule.
Controlul nivelurilor de expresie prin [C]gRNA este o tehnologie importantă care poate fi utilizată pentru diverse aplicaţii, inclusiv pentru implementarea unei terapii genetice precise, spun autorii.
În special, credem că această tehnologie poate avea o contribuţie semnificativă în domeniul medical", a declarat Dr. Kawamata.
„În prezent, evaluăm eficacitatea şi siguranţa sa terapeutică pentru anumite boli ţintă, în experimente de laborator pe celule şi animale, şi o folosim pentru a contribui la dezvoltarea de medicamente terapeutice şi metode de terapie genică, în special pentru boli rare pentru care nu au fost încă stabilite metode de tratament", au menţionat autorii.
Grupul lucrează în prezent la un start-up pentru a răspândi noua platformă de editare a genomului.
Descoperirile au fost publicate în Nature Biomedical Engineering.
